技術(shù)文章 / article
如何能把ELISA實(shí)驗(yàn)做好？操作過程中的注意事項(xiàng)！！
2020-06-30 瀏覽次數(shù)：2675
1. 試劑盒使用前室溫平衡20-30分鐘
溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素，為使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前務(wù)必將所有的試劑平衡至室溫，包括檢測(cè)樣本，避免因溫度的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。若無該過程，可能導(dǎo)致一些弱陽性樣本出現(xiàn)假陰性。
2. 規(guī)范加樣：不規(guī)范的移液操作可能帶來0.1%到5%的移液誤差，甚至更高！
a. 移液器定期校準(zhǔn)：選擇密封性好質(zhì)量可靠的吸頭，吸量不準(zhǔn)確，直接影響檢測(cè)結(jié)果；
b. 加樣前，溶液充分混勻，垂直懸空加入液體，避免加在孔壁上，不可產(chǎn)生氣泡；
c. 加樣時(shí)避免液體濺出，如有樣本濺出，應(yīng)用吸水紙輕輕拭干，并做相應(yīng)記錄；
d. 如果加樣槍漏氣以至于加樣的量不夠，不能用槍吸出再加，做相應(yīng)記錄實(shí)驗(yàn)；
e. 每次加樣順序一致，尤其底物、終止液順序一致，保證每個(gè)孔顯色時(shí)間相同。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品的溶解與稀釋，嚴(yán)格按說明書要求進(jìn)行。
a. 粉末標(biāo)準(zhǔn)品短暫離心，讓因運(yùn)輸沾到管蓋、管壁的標(biāo)準(zhǔn)品沉到管底。
b. 根據(jù)瓶標(biāo)簽加入一定體積的蒸餾水(或說明書溶液），加水后輕柔渦旋震蕩，室溫靜置溶解10-30分鐘，讓粉末*溶解。
注意：加水(或說明書溶液）后暫不用移液槍吹吸，避免蛋白未溶解，槍頭帶出部分蛋白，待*溶解后可吹吸或渦旋振蕩混勻。
4. 標(biāo)準(zhǔn)品和樣本做復(fù)孔
復(fù)孔的目的在于：可以計(jì)算檢測(cè)結(jié)果平均值，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確；通過復(fù)孔結(jié)果對(duì)比，評(píng)估試劑盒的精密度及實(shí)驗(yàn)中是否存在誤操作；
5. 震蕩操作
a. 孵育過程震蕩，可以加快、加強(qiáng)抗原抗體之間的相互碰撞接觸，使得反應(yīng)更加*，OD值通常比未震蕩孵育的結(jié)果要高；
b. 洗滌過程中震蕩，可以使洗板更干凈，很大程度上降低背景值，同時(shí)提高試劑盒檢測(cè)的靈敏度。
6. 洗滌操作
a. 手工洗板，拍板時(shí)要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離；
b. 機(jī)器洗板應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否暢通，若被雜物堵塞可用注射器針頭挑出。
c. 扣干后的酶標(biāo)板應(yīng)立即加液，不能干板太久。
7. 顯色判斷
說明書中提供的顯色時(shí)間僅為經(jīng)驗(yàn)，具體時(shí)間需隨時(shí)注意觀察。通常高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品顏色不再變深，S1、S2、S3有明顯梯度，S5有淡藍(lán)色，或者標(biāo)準(zhǔn)品S1孔在630 nm的OD值在0.5-0.7、S5孔的OD值達(dá)到0.05-0.08，可以終止反應(yīng)。
8. 檢測(cè)
a. 酶標(biāo)儀使用前務(wù)必預(yù)熱10-15分鐘，使結(jié)果更穩(wěn)定；
b. 采用雙波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，排除單波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)的測(cè)定干擾（樣本的干擾、干擾色等）。一般采用大波長(zhǎng)為參考波長(zhǎng)，在參考波長(zhǎng)630 nm(570 nm)下，檢測(cè)物的吸光值小，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm和參考波長(zhǎng)630 nm(570 nm)的吸光值之差可以消除非特異性吸收，雙波長(zhǎng)測(cè)定，可以大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對(duì)酶標(biāo)儀讀數(shù)帶來的誤差，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。
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